Cuestiones jurídicas y bioéticas entorno a la Muerte
Curso dictado por Dra. Teodora ZAMUDIO

Material editado para l@s alumn@s de la U.M.S.A.

 

Clonación y Transferencia nuclear

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‘¡Dios me libre!. La manera de procrear al estilo de antes, la declaramos vana simpleza ...

Si el bruto sigue hallando placer en ello, el hombre, con sus nobles facultades, ha de tener en lo sucesivo un origen más puro, más elevado’.

Goethe, J.W. Fausto (1790)

Antes de entrar en la breve exposición de estos procedimientos y sus aplicaciones actuales y potenciales debe dejarse en claro las diferencias conceptuales de algunos términos, lo que puede tener gran importancia al momento de redactar o interpretar la regulación específica. 

Índice de esta clase:

- Reproducción por clonación

- Reproducción por transferencia de material nuclear

- "Dolly", el caso Roslin

- Repercusiones y avances

- Técnicas de reproducción transgénica

 

 

Reproducción por clonación

El "clon" -entendido literalmente- es la "copia fiel" del originante;

Este procedimiento lleva a cabo la partición de un embrión, o separación de blastómeros totipotentes en embriones preimplantatorios (de 2-32 células). Los embriones más tempranos son mejores para la separación de blastómeros y disminuye con blastómeros más tardíos. Sin embargo, en ovejas, algunos blastómeros de embriones de 4-8 células pueden originar individuos completos.

El procedimiento es el mismo que el empleado para la biopsia preimplantacional. Fuente: Gibs y Berdsley. Scientific American (1994)

La zona pelúcida natural se disgrega con pronasa y se colocan los embriones en Ca para separar los blastómeros.

Los embriones se impregnan en 1% de alginato y se transfieren a medio con  Cl2Ca, que induce la polimerización.

Cada mitad o trozo desgajado del embrión es "absorbido mediante una pipeta [ver gráfico sobre la derecha] y se lo introduce en una zona pelúcida de otro óvulo, o en una cubierta artificial (zona pelúcida artificial), y se implanta.

El resultado son individuos idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas), pero no "idénticos" a sus padres sino "combinación" de sus cromosomas. Serían equivalentes a gemelos monocigóticos.

Hall y Stillman, de la Universidad George Washington, dieron a conocer un experimento de clonación (gemelación artificial o inducida) por separación de blastómeros de 17 embriones humanos de 2, 4 y 8 células,  (obteniendo una media de unos 3 embriones nuevos por cada embrión original).  Los embriones utilizados eran genéticamente anormales (poliploides: fecundados con más de un espermatozoide.) Congreso de la Sociedad Americana de Fertilidad. Montreal, Canadá, Octubre, 13 de 1993

La técnica permite aumentar la dotación de embriones disponibles para la fertilización asistida para aumentar las chances en mujeres con pobre estimulación ovárica.

Esta práctica daría gemelos idénticos ("copias fieles") separables en el tiempo.

Es importante señalar que esta técnica -en sí misma-  NO manipula la carga genética del cigoto e imita a la naturaleza en la que se verifica este tipo de gemelación monocigótica en aproximadamente 1 embarazo de cada 270. [Ver Particularidades del Homo sapiens sapiens].

Reproducción por transferencia de material nuclear

... sin embargo las técnicas biotecnológicas hacen posible una "copia fragmentaria"; es decir, reproducir un individuo con una cuota (seleccionada) de los caracteres de otro. Conocida vulgarmente como “clonación”, debe diferenciarse la aplicación de esta técnica con fines reproductivos de aquella con fines terapéuticos o industriales.

Esta transferencia selectiva puede ser nuclear   consiste en transferir el material del núcleo (incluyendo el ADNnuclear)  de una célula del individuo originante
citoplamática consiste en extraer ADNmitocondrial de una célula proveniente de una donante fértil para introducirla en el gameto de una mujer con problemas de fertilidad por problemas mitocondriales, a fin de que pueda concebir.

Normalmente, en los organismos superiores animales o vegetales la información genética se transmite por mecanismos de reproducción sexual; es lo que se conoce como transmisión genética vertical. Sin embargo, hace ya unos veinte años se logró obtener los primeros ratones transgénicos mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto obtenido por fecundación in vitro; es decir, se trataba de una transmisión genética horizontal, también llamada transgénesis.

Desde el siglo pasado se sabe que es posible clonar plantas a partir de una única célula tomada de alguna de sus partes (tallo, hoja, raíz, etc.). Sin embargo, salvar la distancia entre la clonación de plantas y la de animales iba a llevar su tiempo. No fue hasta 1967 que John Gurdon, destruyó con radiación ultravioleta el núcleo de huevos no fecundados de una especie de rana africana, Xenopus laevis, e inyectó en ellos núcleos de células intestinales (células ya diferenciadas) de la misma especie de rana. Logró de este modo desarrollar embriones, los cuales, sin embargo, morían sin superar el estadio de renacuajos. Los resultados de Gurdon fueron considerados como una indicación de que las células de tejido adulto conservan el genoma completo, pero con alteraciones importantes.

Los primeros métodos de transferencia nuclear en mamíferos fueron desarrollados en ratones y presentaron inesperadas dificultades, aparentemente relacionadas con el ciclo celular, que es de importancia crucial en la determinación de la compatibilidad entre el núcleo donante y el ovocito receptor. En lo que se refiere a ovejas y vacas, dos trabajos fueron particularmente relevantes. Durante la década de los ochenta, S. Willadsen, del Institute of Animal Physiology, en Cambridge, logró la producción de clones ovinos adultos fusionando células de un embrión temprano (que contenía de ocho a dieciséis células) con aproximadamente la mitad del citoplasma de un ovocito no fertilizado. Por su parte, N. First, de Madison University, en Wisconsin, tomando una célula de un embrión bovino de seis días de gestación, consiguió su fusión con el citoplasma de un ovocito anucleado, por medio de una descarga eléctrica. Obtuvo así clones viables de bovinos.

Gráfico 4 Ratón transgénico

A partir de las experiencias de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que inyectaron ADN de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año siguiente, Gordon y Ruddle[1] demostraban la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de genes inyectados en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro. Eran los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgen) de otra especie. Así, Palmiter y sus colaboradores[2] obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiento. Incluso, se obtuvieron también ratones transgénicos gigantes cuando el transgen introducido era el gen humano que codifica para la hormona de crecimiento.

 

"Dolly", el experimento Roslin

En marzo de 1996, K. Campbell, I. Wilmut y sus colegas del Roslin Institute introdujeron una novedad respecto de las experiencias anteriores.

Tomaron las células de un embrión ovino de nueve días y, en lugar de fusionarlas inmediatamente con los ovocitos receptores, las cultivaron in vitro para hacerlas proliferar. Las células fueron posteriormente fusionadas con ovocitos enucleados, originando cinco embriones que se implantaron en los úteros de diferentes ovejas. De esta experiencia nacieron tres corderos que murieron en forma prematura y dos que crecieron normalmente[3].

Gráfico 1 Proceso de  “clonación” de DOLLY.

En apretada síntesis la experiencia observó los siguientes pasos.

Ä Se cultivaron in vitro células de la glándula mamaria – la ubre – de una oveja adulta de raza Finn Dorset que se encontraba en el último trimestre de preñez.

Ä Las células fueron posteriormente fusionadas, mediante un shock eléctrico, con ovocitos (óvulos inmaduros) a los que previamente se les había extraído el núcleo (ovocitos enucleados), provenientes de una oveja de raza Scottish Blackface (blanca con cara negra).

Ä Estos ovocitos, fertilizados de manera artificial, luego de ser activados con una suave descarga eléctrica, comenzaron a dividirse.

Ä Cuando los embriones llegaron a poseer entre ocho y dieciséis células (estadio de mórula), se implantaron en el útero de otras ovejas Scottish Blackface.

Ä Transcurridos 148 días nació un cordero de 6,6kg de peso, totalmente blanco, el primer vertebrado obtenido a partir de una célula tomada de un mamífero adulto.

Estudios moleculares demostraron que la dotación genética del cordero así procreado era similar a la de la oveja de la cual se extrajeron las células de la glándula mamaria, y diferente a la de la oveja utilizada como gestante[4].

Durante el ciclo vital de una célula – con sus dos estadios, la interfase y la división –, la duplicación del ADN se lleva a cabo durante el período S (o sintético) de la interfase. El período que precede al S es el G1 (de gap, brecha), y el que le sucede, G2. EI ciclo de división celular sigue, entonces, los siguientes pasos: G1, S, G2, mitosis, y recomienza en G1. La duración del ciclo es regulada por su detención en un punto específico de G1. En ta1 caso, se dice que la célula se ha retirado del ciclo celular, y que se encuentra en el estado GO. Al reanudar el crecimiento, la célula retoma el período G1, en el cual el contenido de ADN es diploide, es decir, tiene el número normal de cromosomas –dos copias de cada uno–; en el resto de los períodos, es mayor[5]. El ciclo vital de una célula muestra los cambios en el contenido de ADN durante los distintos períodos, en función del tiempo.

El período G1 corresponde a un contenido diploide de ADN (dos copias de cada cromosoma) y

El período  G2, a uno tetraploide (cuatro copias de cada cromosoma). La extensión de cada etapa del ciclo es propia de cada célula.

Gráfico 2 Transferencia de material nuclear

Fuente: Fac. Cs. Agrarias. UNNE (Argentina)

1. Ovocito haploide

2. Eliminación del núcleo  (por radiación o medios mecánicos como absorción por una pipeta) 

3. Núcleo eliminado, el/ los ovocito/s está/n listo/s para ser transferido/s 

A. mórula

B. mórula sin sus cubiertas

C. Células (diploides) disgregadas

D. Succión de una célula con una micropipeta

E. Ruptura de la  célula y liberación del núcleo de la misma

F. Preparación para la inyección

G. Preparación para la inyección

H. Introducción del núcleo/s en la/s célula/s enucleada/s.

I. mórula desarrollada a partir  de la inyección

J. Blastocisto desarrollado a partir  de la inyección.

Los pasos de D a H pueden reemplazarse por la fusión de ambas células.

Obviamente si se inyectan núcleos provenientes de células de un mismo origen todos los embriones desarrollados tendrán la misma información genética nuclear, pero debe recordarse que la información genética mitocondrial será la de la oveja donante del ovocito.

Repercusiones y avances

A partir del experimento denunciado por el equipo del Dr. Walnut del Instituto Roslin de Edinburgo (Escocia) se ha trabajado con varias hipótesis:

el material nuclear  de células somáticas habría recobrado la totipotencia perdida a partir de la quinta subdivisión celular del ovocito fecundado mediante la técnica de “empobrecimiento” al que se somete a la célula donante del material nuclear.

un estudio llevado a cabo por investigadores del Instituto Whitehead indica que los animales clonados presentan anormalidades en la expresión genética, que se deben a irregularidades en el gen de impresión que se emplea para llevar a cabo la clonación. Teniendo en cuenta estos resultados, la falta de expresión en los genes impresos hace que la clonación terapéutica sea menos promisoria, ya que los genes impresos tienen un papel clave en el desarrollo del embrión.

el equipo de Rudolf Jaenisch y Ryuzo Yanagimachi, hipotizó por primera vez cómo los clones que parecen normales presentan graves anomalías que afectan a la expresión genética y que no se manifiesta en características externas. Estos resultados confirman las sospechas previas de que los clones no sólo son ineficientes, sino que también pueden ser inseguros[6]. El análisis sirvió para discernir si los problemas de los clones venían dados por aberraciones en las células donantes o en el procedimiento de clonación[7].

datos actuales parecen indicar que la transferencia nuclear no revierte la edad genética, por lo que se debe enfrentar el peligro de acumulación de mutaciones y de envejecimiento celular. Hay informes sobre anomalías en este sentido, por ejemplo, un acortamiento significativo de los telómeros, lo que parece un indicio de la edad celular[8]. Los telómeros restauran su longitud normal en la línea germinal, que por definición no tuvo lugar en la producción con este tipo de técnica. Es posible que los efectos fisiológicos en el acortamiento de la edad de los animales clonados se reflejen tras varias generaciones. Sin embargo, otros informes sobre las terneras clónicas parecen indicar que ocurre lo contrario, un rejuvenecimiento según ciertos parámetros moleculares.

Por su parte, el protocolo de investigación del grupo de Wakayama se apoya sobre un esquema que permitiría la clonación ilimitada a partir de casi cualquier célula del organismo:

Transferencia por microinyección de un núcleo de célula somática a un óvulo enucleado.

Se dejaría desarrollar el embrión in vitro hasta una fase previa a la de implantación.

A partir de las células de la masa interna del blastocisto se pueden establecer cultivos estables (inmortales) de células madre (ES). Todas esas células contendrían el mismo genoma nuclear que el individuo donante, genoma que quedaría de esta forma “inmortalizado”.

De hecho, las células madres y las células embrionarias por sí mismas no pueden producir placenta, por lo que no son viables al ser transferidas al útero. Pero si se mezclan con otras células embrionarias y se encapsulan en zona pelúcida, podrían generar embriones viables que conducirían a quimeras somáticas. Incluso, en ratones se ha visto que al transferir células madres a un blastocisto huésped tetraploide, las células de éste mueren sobreviviendo las células madres, que son las responsables de originar un ratón completo. Así pues, aunque las células madres no pueden dar origen por sí mismas a un nuevo individuo, pueden hacerlo al ser colocadas en un ambiente celular adecuado: el que pueda generar el trofectodermo que produce la placenta[9].

En julio de 2001, en una conferencia realizada durante el XVII Congreso de la Sociedad Europea de Reproducción Humana y Embriología -Eshre- (Suiza), científicos del Centro de Medicina Reproductiva e Infertilidad de la Cornell University de Nueva York, Estados Unidos, anunciaron  una nueva técnica que permitiría crear ovocitos maduros mediante la implantación en óvulos donados de núcleos de células somáticas o adultas.

para reducir la diferencia cromosomática los investigadores quitaron el núcleo de un óvulo donado y le colocaron el de una célula adulta.

en su nuevo hábitat, y con la ayuda de electroestimulación, el núcleo de la célula adulta (con 46 cromosomas) se dividió en dos partes o pronúcleos, de 23 cromosomas cada una.

llegada esta etapa, los expertos quitaron uno de estos pronúcleos e insertaron el material genético contenido en el esperma del padre.

A pesar de que el procedimiento se realizó sobre 150 óvulos sólo en un puñado de ellos se observó división celular. Esta técnica -desarrollada por el equipo de Takumi Takeuichi- lograría seres humanos con un aporte tripartito de genes: padre, madre y donante del óvulo que aportaría el material cromosomático mitocondrial.

Técnicas de reproducción transgénica

En resumen, las técnicas de obtención de animales transgénicos son:

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Microinyección de ADN en núcleo de ovocito

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Microinyección de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)

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Electroporación de cigoto

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Transfección de células totipotentes

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Co-inyección en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno 

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Vectores virales 

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Transfección de gametos 

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Transferencia de núcleos transfectados (clonación)

Evidentemente, los diferentes procedimientos pueden ser combinadas  con inseminación artificial, superovulación, homocigotización, transferencia de embriones quiméricos.

Más allá del amarillismo de las noticias mediáticas, las biotecnologías prometen seguir avanzando en el campo de la reproducción de animales superiores ... y por ende, del hombre.

 

 

 


NOTAS:

horizontal rule

[1] Gordon,J.W.; Ruddle,F.H. Integration and stable germ line transmissions of genes injected into mouse pronuclei. Science, 214:1244-1246. 1981

[2] Palmiter,R.D.; Norstedt,G.; Gelinas,R.E.; Hammer,R.E.; Brinster,R.L. Metallothionein-human GH fusion genes stimulate growth of mice. Science, 222:809-8141983.A mitad de los 80 se venían produciendo paraclonaciones en diversos animales de granja: ovejas y vacas (M.Sims, N.L. First (1994): Production of calves by transfer of nuclei from cultured inner mass cells, Proceedings of the National Academy of Sciences 91: 6143-6147) Willadsen logró terneros por transferencia de núcleos de embriones en fase de hasta 128 células. (S.M. Willadsen (1986): “Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte”, Biology of Reproduction 37: 859-866).

[3] Davor Solter, de uno de los institutos Max Planck, dedicado a la inmunobiología, fue explícito al comentar que la clonación de mamíferos a partir de células adultas resultará considerablemente más difícil, pero no debe ser considerada imposible; aclaró que el problema crucial que restaba resolver era el de la compatibilidad entre el citoplasma receptor y el núcleo donante, todavía poco comprendida. En este punto radicó el éxito del trabajo de Wilmut y sus colegas, esto es, en el hallazgo de un método que, una vez efectuado el transplante e iniciado el desarrollo, haga compatibles al núcleo donante – tomado de una célula somática de tejido adulto – con el citoplasma del ovocito receptor. Dicha compatibilidad dependería de la posibilidad de sincronizar las fases en las que se encuentren ambos antes de la fusión. Nature de marzo 1996.

[4] La célebre oveja obtenida de la célula mamaria, bautizada Dolly, representa apenas un 3,4% de efectividad respecto del número total de núcleos transferidos. Se ha descrito igualmente la producción de monos Rhesus por transferencia de núcleos de blastómeros (L. Meng, J.J. Ely, R.L. Stouffer, D.P. Wolf (1997): Rhesus monkeys produced by nuclear transfer, Biology of Reproduction 57: 454-459). En un caso se dividieron 107 embriones en 368 unidades, lográndose 4 embarazos, de uno de los cuales nació Tetra. (D. P. Wolf, L. Meng, N. Ouhibi, M. Zelinski-Wooten (1999): Biology of Reproduction 60: 199). Alguno de los intentos condujo a embarazos “ciegos”, consistentes en un saco placentario desprovisto de tejido fetal. Pero los autores anunciaron  que finalmente lograron 4 embarazos, cada uno con un feto viable, a partir de los últimos 7 embriones originados por separación de blastómeros. Dos de los fetos -Neti y Ditto- gemelos idénticos por fisión de un embrión original.

[5] En las experiencias previas realizadas con mamíferos, el núcleo tomado de un embrión temprano se encontraba, la mayoría de las veces, en las fases S o G2 (en las que existen más de dos y hasta cuatro copias de cada cromosoma). En estos casos, al ser implantado el núcleo en un ovocito detenido en una fase sólo compatible con núcleos diploides, habría replicaciones adicionales, lo cual impediría el desarrollo normal del embrión. Wilmut y sus colegas lograron evitar esta asincronía reduciendo drásticamente la concentración de nutrientes del medio en el cual se hallaban en cultivo las células que aportarían sus núcleos, lo que inactiva sus ciclos de crecimiento y las detiene en la fase GO. Así se logró una mejor sincronía en los tiempos de replicación, una vez transplantados los núcleos e iniciado el desarrollo del embrión.

[6] El estudio se ha centrado en analizar los mecanismos de la escasa supervivencia y el sobre-crecimiento de los animales clonados. El citado grupo ha desarrollado clones de ratones desde células madre embrionarias y ha monitorizado la actividad de los genes impresos, que son los que controlan por porciones especiales y que no afectan a su secuencia base. Los investigadores se centraron para ver si dichas zonas genéticas se podían reproducir fielmente en los ratones clonados y en las células donadas que se emplearon en dichos clones, ya que vieron que eran unos cultivos extremadamente inestables. Cuando las dividieron en cultivos, el equipo del Instituto Whitehead observó que incluso los clones desarrollados a partir de las células madre de una hermana presentaban diferencias en su expresión genética. La técnica es sumamente ineficiente hasta ahora: si se tuviera la eficiencia del caso Dolly, serían necesarias 200 mujeres para “clonar” un homo sapiens sapiens. A lo que debe agregarse la incidencia de nacimientos muertos y abortos. Según se ha relevado hay un patrón continuo de muertes durante el desarrollo embrionario y fetal, llegando a término sólo 1-2% de los embriones. Cibelli, J.B. et al.; Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts Science 280: 1256-1258. 1998

[7] Los animales producidos por clonación son mayores que los nacidos de forma natural. Parece ser que dicha anomalía aparece porque los denominados fetos grandes disponen de un nivel menor del receptor del factor de crecimiento insulínico IGF2R, que inhibe otros factores que regulan el crecimiento de los fetos, según un trabajo del equipo de Lorraine E. Young, del Instituto Roslin, en Edimburgo. El trabajo sostiene la hipótesis de que la metilación del ADN en procesos de manipulación embrionaria produce alteraciones epigenéticas y, por eso, deberían analizarse los embriones clonados antes de su implantación para evitar disfunciones.

[8] Shields, P. G. et al. Analysis of telomere lengths in cloned sheep, Nature 399: 316-317. 1999

[9] El trabajo del grupo de Wakayama logró clones de ratón inyectando núcleos de células madre en ovocitos. Esto significa que, aunque las ES por sí mismas no sean totipotentes, su núcleo transferido puede programar la diferenciación de individuos completos (es decir, posee totipotencia nuclear). Ello abre, además, la posibilidad de generar ratones transgénicos en un solo paso, sin necesidad de pasar por la fase de quimeras somáticas. La manipulación genética de estas células madre y su ulterior clonación facilitará sobremanera la creación de clones transgénicos. T. Wakayama, I. Rodríguez, A.C.F. Perry, R. Yanagimachi, P. Mombaerts Mice cloned from embryonic stem cells, Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 14984-14989. 1999